Så funkar dna-analys

Delar av gamla virus
Intronerna kan vara delar av gamla virus som avlats in eller delar av genen som repeterats och sedan stängts av och inte förefaller ha någon funktion.

Mycket tyder på att det är i vissa intron som centriolerna griper tag, de spindelliknande strukturer som bildas i cellen vid delningen. Centriolerna tar tag i dna och drar isär molekylen i två likadana halvor. Det verkar som att naturen sällan skapar någonting onödigt.

– Anledningen till att vi inte undersöker exonet är att det innehåller genmaterial och att individer är relativt lika varandra i exonerna. Vi har inte tillåtelse att ta reda på om någon till exempel har sjukdomsanlag eller blå ögon, säger Kerstin Montelius.

– De repetitiva intronerna har större individuell variation och de vi tittar på ger oftast uteslutningsnoggrannhet på 99,99 procent, vilket är fullt adekvat.

Markörerna består av enheter som repeteras om och om igen, så kallade short tandem repeats. Dessa förekommer i olika längder och är nedärvda. Har fadern en åtta-sekvensgrupp och modern en fyra-sekvensgrupp, ska båda finnas hos barnet. Barnen blir nästan alltid exakta kopior av föräldrarna, åtminstone vad gäller short tandem repeats. Men då och då uppstår en mutation på en repeat, alltså en felläsning vid replikeringen. Det här kan man emellertid kompensera för vid analysen.

Kerstin Montelius, genetiker vid Rättsmedicinalverket.

GATA-GATA-GATA
– Metoden för att identifiera de olika intronerna är att mäta deras längd genom att räkna basparen. Den längsta som vi använder är cirka 350 baspar och den kortaste är 106. De här bilderna (ovan) visar ett enkelt fall med basparen GATA-GATA-GATA, men alla möjliga kombinationer förekommer och det är det som skiljer två lika långa introner åt, säger Kerstin Montelius.
Hur kommer man åt dem?

– Man låter särskilda, konstgjorda primrar, smådelar av dna, fästa på så kallade flankerande sekvenser, intilliggande strängar av cirka 20 baspar som är speciella för varje markör. De flankerande sekvenserna är kända och det finns olika typer av primrar som fäster vid olika flankerande sekvenser. Man tillsätter också lösa nukleotider – A, C, T och G – som får simma omkring i vätskan. Därefter värmer vi upp provet till 96 grader i några minuter under det så kallade initieringssteget. Så sätter man fart på polymeraset, bygg-enzymet, som ska användas senare.

Cykeln börjar därefter med denatureringssteget där man håller lösnigen vid 94 grader i 30 sekunder, varvid dna-molekylen denaturerar, dubbelspiralen delas upp i två enkelsträngar. Den höga temperaturen gör att bindningarna mellan basparens nukleotider lossnar, alltså C lossnar från G och A lossnar från T. I lösningen finns nu enbart enkelsträngat dna, det som kallas för dna-mallar.

Nästa steg är hybridiseringssteget, då man sänker temperaturen till 57 grader under 30 sekunder, och då fäster primrarna vid dna-mallarna.

Därpå följer polymeriseringssteget i vilket man höjer temperaturen till 72 grader och polymeraset, bygg-enzymet, följer molekylen och bygger på rätt nukleotid ur lösningen på molekylen och åstadkommer en dubbelsträngad molekyl igen, ungefär som när cellen delar sig normalt. Men polymeraset bygger bara på intronet mellan primrarna. Resten av dna-mallen förblir enkelsträngad och orörd.

SÅ FÖRSTÄRKS DNA: Det är i dna-förstärkaren Geneamp från Applied Biosystems som amplifieringen blir av, då dna-proverna temperaturcyklas tillsammans med primrar och nukleotider. Efter 30 cykler har dna-bitarna duplicerats 2^30 gånger, alltså 1 073 741 824 gånger. Det räcker för att få en tydlig bild.




Displayen på Geneamp visar precis vad som är på gång. Amplifieringen börjar med att provet hettas upp till 96 grader i två minuter. Därefter börjar cykeln med att provet hålls i 94 grader i 30 sekunder, 59 grader i 2 minuter och sedan i 72 grader i en och en halv minut, och så vidare. Cykeln avslutas med ett sista polymeriseringssteg i 60 grader. Efter ett par timmar är allt klart och maskinen går till en väntefas i 4 graders temperatur.