Så funkar dna-analys

Delar om och om
Genom att cykla temperaturen i de här stegen – med 94, 57 och 72 grader – kommer man att om och om dela det nybyggda intronet, haka på nya nukleotider, dela och haka på, medan den ursprungliga molekylen blir ointressant i mängden.

Mängden intron ökar exponentiellt. 30 cykler brukar vara tillräckligt, det ger över en miljard kopior på några timmar. Metoden kallas pct, polymerase chain reaction, och gav uppfinnaren Kary Mullis Nobelpriset i kemi 1993.

– Vi använder oss av 16 olika primerpar. Den ena primern i paret har en särskild egenskap: den har en egen färg. En laser exciterar elektroner i färgen, som avger blå, grön, gul, röd och orange fluorescens, berättar Kerstin Montelius.

Nu sätter man i ett antal provrör med 10 mikroliter lösning i en platta och monterar i en elektroforesapparat som suger upp lösningarna i kapillärrör med 3–4 mikrometers diameter. Inuti kapillärerna finns ett gel med mycket fina hål som dna-fragmenten får stånga sig igenom. Gelen är polyakrylamid, samma ämne som man tänkte täta Hallandsåsen med. Eftersom fragmenten är negativt laddade lägger man på +2 kilovolt upptill i kapillären, och fragmenten börjar vandra uppåt.

De kortare bitarna har lättare att ta sig fram och kommer först, medan de längre fragmenten når fram senare. Sålunda blir de sorterade i storleksordning. När de passerar genom laserhuvudet fluorescerar de och färgerna registreras av en sensor. Mätningen ger tre koordinater: färgen, intensiteten och tiden (som är detsamma som längden).

Bandmönstret omvandlas i ett program till toppar på en skala, en så kallad allel-stege, där intensiteten normaliserats. X-axeln på skalan anger antalet baspar, från 106–350, och skalan visar distinkta steg som är antalet repeats som färgats med en markör. Namnen på markörerna som är ansvariga för de olika infärgningarna visas ovanför skalan – D8S1179, D21S11, D7S820 och så vidare.

SÅ ANALYSERAS DNA: Kapillärelektrofores, alltså när man sorterar de förstärkta dna-fragmenten i storleksordning, sker i den här apparaten. Den kan göra 16 samtidiga analyser. Proverna matas in i maskinen i plattor om 16 och 16 (P). Plattan förs upp mot nederänden av de 16 kapillärerna (K) där dna-fragmenten börjar vandra uppåt genom gelen i kapillärerna, dragna av 2 kilovolt högspänning. Dna-fragmenten är märkta med primrar, markörer som fluorescerar i ultraviolett laserljus när de passerar laserskannern (L). När allt dna har vandrat igenom scannern startar en pump (P) som pumpar ut alltihop, gel såväl som dna-bitar, i avloppet (A). Därefter pumpar pumpen upp ny, ren gel ur andra provrör och analysen kan börja om med en ny platta.




Sensorn i elektroforesapparaten, som detekterar de fluorescerande primrarna, visar upp sitt resultat på en så kallad gelbild i programmet Foundation Data Collection. Dna-soppan kommer drivande från höger och det första man ser är en gröt av primrar som inte hakat på något dna. De är allra lättast (20 baspar) och kommer därför först och kan sorteras bort i analysen. Därefter kommer de färgmärkta kortare dna-fragmenten och ju längre åt höger man kommer, desto tyngre är fragmenten. Det är 16 spår eftersom just den här maskinen klassificerar 16 kapillärer åt gången. Det lite mörkare spåret i mitten är ett testspår med en testblandning där dna-fragmenten ska dyka upp med kända intervaller. Under körningen kontrollerar man bilden för att se att man får klara färgband och inte för mycket brus, om till exempel pcr-reaktionen inte skulle ha fungerat tillfredsställande.

Far, mor och barn under lupp
Antag nu att man vill undersöka om en man är far till ett barn. Då tar man prov från mor, far och barn och analyserar dessa parallellt. Barnet ärver en allel, en plats på dna-molekylen från varje förälder, och om man kan härleda barnets alleler till respektive förälder, är mannen sannolikt fadern.

På bilden (skärmdumpen ovan) ser du ett exempel där barnet har allel 30 för markör D21S11 från mor eller far, allel 12 för markör D7S820 från mor eller far och allel 9 från far. För markör CSF1PO har barnet fått allel 10 från mor och 12 från far. Det här räcker för att fastställa faderskapet. Det kan tyckas vara ganska få värden att arbeta med, men man använder betydligt fler primers än de som visas på den här bilden och hamnar på en uteslutningssäkerhet på omkring 99,99 procent eller högre. Datorn sammanställer siffervärdena till ett protokoll.